多糖β-1,2-葡聚糖由通過β-1,2-糖苷鍵連接在一起的葡萄糖重復單元組成。環狀 β-1,2-葡聚糖 (CβG) 存在于不同的細菌物種中，在細菌感染和共生關系中發揮作用。CβG 生物合成由環狀 β-1,2-葡聚糖合酶 (CGS) 催化，CGS 是一種催化線性 β-1,2-葡聚糖 (LβG) 環化(閉環形成)的酶。

由于大規模酶法合成線性β-1,2-葡聚糖的方法已經建立，將其與該酶結合用于高效一鍋法合成環狀β-1,2-葡聚糖在技術上是可行的。但該酶的環化活性不是很強，而且作為酶的穩定性也較低。

先前的研究表明，葡萄糖與 CGS 的鍵合、LβG 鏈的延長、葡聚糖鏈長度的調整和葡聚糖的環化分布在 CGS 的三個不同域中。然而，雖然已知 CGS 中部區域的酶結構域會環化 LβG，但迄今為止，科學家們仍不清楚該過程的詳細機制。

最近，來自一組研究人員通過對意大利熱厭氧桿菌(TiCGS Cy )的CGS環化結構域進行功能和結構分析，揭示了CGS環化的催化機制。該團隊由東京理科大學(TUS)應用生物科學系助理教授 Nobukiyo Tanaka 領導，成員包括 Br. 來自啟迪科技大學的 Ryotaro Saito、副教授 Masahiro Nakajima 和 Tomoko Masaike 副教授，以及來自新瀉大學的 Hiroyuki Nakai 副教授和來自日本產業技術綜合研究所 (AIST) 的 Kaito Kobayashi 博士。

他們的研究結果已于 2024 年 2 月 1 日發表在《應用微生物學和生物技術》雜志上 。Tanaka 博士闡述道：“從生理學角度來看，CGS 是重要的酶，因為 CβG 與各種細菌疾病和共生關系有關。我們熱衷于提供對 CGS 結構和功能的見解，CGS 在研究中受到關注，但 β -1,2-葡聚糖環化機制仍然是個謎。”

研究的第一步涉及在大腸桿菌中單獨表達環化結構域 TiCGS Cy作為重組酶。表征的下一步涉及分析當 LβGs 用作 TiCGS Cy的底物時的反應產物。“我們發現TiCGS Cy產生 β-葡萄糖苷酶抗性化合物。在使用核磁共振波譜檢查它們時，我們發現了 CβG。這是TiCGS Cy產生 CβG的第一個證據，” Tanaka 博士解釋道。

為了確定 TiCGS Cy對 LβG的作用模式，研究小組用 β-1,2-葡萄糖寡糖(包含 2-10 個葡萄糖單位的 LβG)處理 TiCGS Cy并分析產物。反應產物表明，TiCGS Cy機制缺乏水解反應，具有轉糖基作用，并且需要長度至少為六糖(六個或更多葡萄糖單元的聚合物)的底物。這一發現與之前研究的數據相匹配，之前的研究中相關 CGS 產生的 CβG 具有約 20 個葡萄糖單元的聚合物。最后，有人認為 TiCGS Cy具有端基異構體保留機制，因為它生成與其底物具有相同端基異構體的產物。

此外，使用X射線晶體學對TiCGS Cy進行結構分析表明，TiCGS Cy與來自Chitinophaga pinensis(CpSGL，屬于GH144)和真菌Talaromyces funiculosus(TfSGL，屬于GH162)的β-1,2-葡聚糖酶在結構上相似，雖然它們的氨基酸序列同源性很低。

將CpSGL(GH144)的配合物結構、TfSGL(GH162)的米氏配合物結構和TiCGS Cy的整體結構疊加，探索TiCGS Cy的催化殘基。結果發現，E1356位于通過+2位點葡萄糖分子的3-OH基團作用于裂解位點糖苷鍵氧原子的位置，而E1442位于直接進行裂解位點的位置。對亞位點 –1 的異頭中心進行親核攻擊。因此，推測它們分別是一般酸/堿和用于催化的親核殘基。

TiCGS Cy的詳細反應機理如下：

(a) E1356 充當催化的通用酸，通過葡萄糖分子 +2 子位點的 3-OH 基團向氧原子提供質子。同時，E1442 作為親核試劑，攻擊子位點 –1 的異頭中心，形成糖基酶中間體。

(b) E1356 充當通用堿，通過 +2 子位點葡萄糖分子的 3-OH 基團從 +1 子位點葡萄糖分子的 2-OH 基團吸引質子。

(c) 子位點 +1 處的活化 2-OH 基團攻擊子位點 –1 處的異頭碳，釋放糖基轉移產物。

在上述反應中，表明當來自與形成糖基-酶中間體的分子不同的分子的羥基攻擊(a)中的異頭碳原子時，獲得直鏈產物。相反，當攻擊羥基來自同一分子時(圖1)，就會形成環狀產物。

總的來說，這些發現對于 TiCGS Cy的表征具有重要意義。“鑒于其非規范反應機制，該 CGS 定義了一個新的糖苷水解酶家族 GH189，” Tanaka 博士說。

總之，通過這項研究，研究人員確定了對環化活性重要的殘基，從而有望尋找具有更強環化活性和更高穩定性的酶。該團隊相信他們的工作將為探索 CGS 的抑制開辟研究途徑。